缓冲盐用错了怎么办？！

展源 2025-04-29

缓冲盐用错了怎么办？

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在色谱分析过程中常常需要使用缓冲盐来调节流动相的pH 值，缓冲盐的不当使用对可能造成柱压升高、柱效下降以及使化合物的保留时间发生变化等影响，缓冲盐使用不当对的影响及解决办法。

缓冲盐是指对pH有缓冲能力的盐，能够让pH维持在一个恒定的数值。

何时应用缓冲盐

样品或样品中需研究的关键杂质有离子化倾向，其他特定少数情况另行叙述。

存在较强离子化倾向的组分，其中一部分是分子状态，与反相色谱固定相结合的更好；另一部分是离子状态，更亲和于流动相。如不使用缓冲盐控制其电离状态，即分子状态和离子状态的比例，很容易出现峰拖尾分叉变形的情况。这种情况下一般就不应该使用水/有机相系统作为流动相，应选用缓冲盐/有机相系统。

常见的缓冲盐有哪些

缓冲盐类型的选择，主要取决于所需要的缓冲能力，在反向色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型的样品的保留随pH改变而明显变化。通常在pH2到4条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高。因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。缓冲盐溶液的pH值越接近其pka，缓冲能力越强。一般缓冲盐溶液的pH值应在其pka±1的范围内。

比起单纯的酸碱，盐类，特别是具有缓冲能力的盐类可以很好的控制流动相的pH值，根据不同缓冲盐中两种盐的配比，可以很容易的配置出一定pH的缓冲溶液。

1、甲酸盐

通常在液相色谱中常用的甲酸盐都是甲酸铵，这类盐的溶解度好，完全兼容液质联用的方法，对的伤害也比较小，但是缺点是离子强度比较低，另外就是甲酸盐比较容易吸潮，称量的时候比较困难，在流动相里还可能挥发。

与甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸铵缓冲体系，大概缓冲能力在pH3～4.5的范围之内，只要调节两者浓度的比例即可。

2、乙酸盐

常见为乙酸铵，在使用上，和甲酸盐十分类似，离子强度也不高，与乙酸配合的乙酸-乙酸铵缓冲体系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

3、磷酸盐

常用的是磷酸的钠盐和钾盐，二者对pH的控制能力十分接近，只是离子强度稍有差异，绝大多数情况下是可以互换使用的，磷酸由于是多元酸，能够形成一氢盐和二氢盐，所以使用磷酸缓冲体系调节pH也是组合比较多，跨度比较大的，并且可以提供较高的离子强度，可惜，磷酸盐流动相体系无法兼容质谱，并且对损伤较大。

以磷酸钠盐为例，可以有以下两种组合的缓冲体系：

磷酸-磷酸二氢钠：pH可以达到1.2～3.1左右的范围

磷酸二氢钠-磷酸氢二钠：pH可以达到6.5～8左右的范围

上述的缓冲对能调节的pH范围指的都是在保持缓冲能力的范围之内，如果仅仅是调节pH的话，范围还可以再扩展一些。

缓冲盐使用不对产生的影响

1、柱压升高

原因：缓冲盐使用不当导致缓冲盐析出，堵塞塞板和键合相颗粒之间的孔隙，阻碍流动相传质，引起柱压升高;

2、相同化合物的保留时间发生变化

原因：如果没有冲洗干净就进行进样，内含有的盐会使化合物的保留时间发生变化;

3、柱效下降

原因：有些缓冲盐会渗入到键合相的深处，损害硅胶基体，导致键合相流失，柱床变松，柱效下降;ii)凝结在键合相表面，使C18碳链难以舒展，对物质的保留能力下降，导致柱效下降。因此用过缓冲盐后需要对进行冲洗，水中缓冲盐浓度较大时应特别引起注意。

缓冲盐的正确使用方法

1、使用前的处理: 在使用缓冲盐作流动相之前需要用不含缓冲盐的流动相冲洗，直至基线平稳。原则上，用于冲洗的流动相与分析时所用的流动相含水的比例相同(或含水更多)，不同的只是用于冲洗用的流动相中不含缓冲盐。

理由：缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂。用含缓冲盐的(特别是做流动相的水为饱和的缓冲盐溶液时)流动相进行分析时，如果分析前中用于保存的流动相中含水的比例相对较小，不先冲洗掉，接下来做样品的时候所用的流动相中如果有机溶剂含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解该缓冲盐时，缓冲盐将会在柱体上析出，沉积下来，这将可能导致上述对的损害。

2、使用后的处理：用与分析时含水比例相同的流动相(与分析用流动相唯一的区别是，用于冲洗的流动相不含缓冲盐)进行冲洗约30min，直至基线平稳。如果该在接下来很长的一段时间内不使用，要长期保存，则需再加上一步，即用纯的有机溶剂冲洗一遍，直至基线平稳。

用与分析时含水比例相同的流动相(与分析用流动相唯一的区别是，用于冲洗的流动相不含缓冲盐)进行冲洗约30min，直至基线平稳。如果该在接下来很长的一段时间内不使用，要长期保存，则需再加上一步，即用纯的有机溶剂冲洗一遍，直至基线平稳. 缓冲液可以提供离子平衡的反离子，并使流动相保持一定的离子强度和ph值，减少拖尾。

使用缓冲液要注意几点

1、避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。

2、缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。

3、实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会处使盐类析出，造成液路或堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。

4、使用缓冲液要及时掌握ph范围，做到胸中有数。

5、清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。

6、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路(拆下柱子，走30ml,再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞。

7、选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。

如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的，是洗不出来的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇冲洗，是可以把缓冲盐冲洗出来的，然后用纯的有机溶剂来保护柱子。最好的方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换，一般在15分钟以内最好，且用0.8的流速较好. 如果用纯水冲，容易造成键合的碳链的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液冲. 可以用纯水代替流动相中的缓冲液，有机相不变。这样冲洗柱子比较稳妥。

流动相流速的选择

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

a.由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

c.含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

d.流动相要求使用0.45 µm滤膜过滤，除去微粒杂质。

e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长的使用寿命，提高柱性能。